喻凤香，林亲录
（湖南农业大学食品科技学院，长沙  410128)

摘  要：本文综述了淀粉酶的分类，根霉淀粉降解酶类及其性质和作用机理，不同根霉糖化发酵糯米产物成分分析现状及研究前景。
关键词：根霉；淀粉酶；甜酒；低聚糖

根霉高产淀粉酶系常用于发酵。另外也含有少量的酒化酶系又产乙醇及有机酸［1］，常增加酿造产品的风味。甜酒是利用甜酒曲将蒸熟的米饭糖化发酵制作而成，甜酒的风味和营养关键决定于甜酒曲的质量。甜酒曲中起主要作用的是根霉和酵母菌，根霉是主要的糖化菌。甜酒的制作主要是利用根霉所产的淀粉酶将糯米淀粉分解成单糖、糊精和少量还原糖及低聚糖类等，形成糯米甜酒独特的风味。对甜酒酒曲根霉淀粉酶类的研究是各甜酒及酒曲生产厂家和广大的科研人员的研究重点之一，也是筛选优良酿酒根霉的重要依据。
1  甜酒酒曲根霉淀粉酶类及其性质、作用机理
1.1  根霉淀粉酶类
对淀粉酶的分类和作用机制研究报道较多［2,3,4］，可按来源、产物旋光度、作用机制等进行分类。但近年随着酶学研究的发展，对酶的作用机制、方式等研究不断取得新成果，分类学问题出现许多难点［5］。常见的淀粉酶可以分为以下几种：α-淀粉酶（α-amylase,EC3.2.l.1），也叫液化酶；β-淀粉酶（β-amylase,EC3.2.1.2）；葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase，EC3，2.1.3），也叫γ-淀粉酶，简称糖化酶（缩写GA或G）：异淀粉酶（isoamylase,EC3.2.1.68,糖原6-葡聚糖水解酶）等。我国在食品方面研究和应用的微生物酶估计有30种［61，其中淀粉酶有α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、普鲁兰酶、环糊精生成酶等。
根霉可以产生丰富的糖化酶系，其次是α－淀粉酶、异淀粉酶等。关于根霉的酶系，日本的上田诚之助于1984年测定了16株根霉的5种酶的活性，包括糖化酶、α-淀扮酶、果胶酶、木聚糖酶、羧甲基纤维素酶等。另外，方心芳、乐华爱等也曾研究过根霉产生果胶酶、延胡索酸、甚至甾族激素。根霉产生麦芽低聚糖酶已见报道，刘建军［7］等从淀粉厂土样等样品中分离筛选到一支产淀粉降解酶的根霉菌株，经紫外线及辐射诱变和自然分离，获得一支突变菌株PE一8，经高压液相色谱和纸层析分析证明，其分泌的淀粉降解酶类作用于适当液化的玉米淀粉产物中麦芽三糖至麦芽八糖的比例达77.6％、葡萄糖含量仅为3.03％，属于麦芽低聚糖。说明根霉PE-8菌株分泌的淀粉降解酶类不同于葡萄糖淀粉酶或α-淀粉酶，属于低聚糖酶。金其荣［8］等研究开发出来的一种高温根霉菌，在麸皮上50℃培养18～20h，分泌大量低聚糖酶。
1.2  甜酒酒曲根霉淀粉酶性质
甜酒酒曲根霉在甜酒制作过程中主要利用其中的淀粉酶系将糯米淀粉降解为糖类物质。糯米几乎不含有直链淀粉，主线是由α-1，4键连接，并具有α-1，6分支点，称为支链淀粉。α-淀粉酶，水解直链淀粉和支链淀粉内部的α-1，4键，产生短链的低聚糖混合物，在酿造工业中，这些糖被称为α-极限糊精，因为他们已经达到了小麦淀粉酶水解淀粉的极限程度。真菌α-淀粉酶与细菌α-淀粉酶不一样，真菌α-淀粉酶对热相对敏感，并且是产生麦芽糖为主和其他低聚物的麦芽淀粉酶，可以用来代替高麦芽糖浆产品中的α-淀粉酶［9］。
与α-淀粉酶相比，β-淀粉酶是一种外切酶，从淀粉分子的非还原性末端将麦芽糖残基裂开，不能裂解α-1，6分支点，也不能饶过这些分支点来水解和消化糖，得到的产物是比α-极限糊精更大的糊精（定义为β-极限糊精）。目前市场上生产的β-淀粉酶基本上来源于小麦芽，微生物β-淀粉酶的报道较少，中科院利用蜡状芽孢杆菌生产的β-淀粉酶用于啤酒生产，可代替20％的麦芽。
葡萄糖淀粉酶可以迅速的从淀粉的非还原性末端将淀粉水解，释放出葡萄糖，并像β-淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β-D-葡萄糖。它也可以微弱的水解α-1，6糖苷键和α-1，3连接的碳链，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖，因此被广泛地应用于酒精、白酒、抗生素、氨基酸、有机酸、甘油、淀粉糖等工业中，是我国产量最大的酶制剂产品［10］。要得到水解这些α-1，6分支点更大的酶活性，可以外加更多的酶量，但是这将导致产生一些副反应，称为“回复”现象，其中产生的葡萄糖分子发生重聚作用，形成异麦芽糖，由此使得葡萄糖的产物降低［9］。真菌产糖化酶组分多型性是常见的，Rhizopus nivenus和Chalara paradoca可分别产生5种和6种活性组分［1］［2］。20世纪80年代，对于糖化酶的研究发展极快，主要集中于糖化酶菌株的分离及其纯化工作。长期研究证明，糖化酶广泛地分布在微生物中，主要存在于黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中，同时也存在于人的唾液、动物胰腺及细菌中。己报道的产糖化酶真菌微生物有23个属35个种，细菌有3属3种［10］。现在工业上用得最多的、研究得较深入的葡萄糖淀粉酶是Aspergillus和Rhizopus等霉菌的淀粉酶［5］。
异淀粉酶和支链淀粉酶（EC3.2.1.41，聚麦芽三糖6-葡聚糖水解酶）都是脱支酶 （debranching enzyme），他们专一性的作用于α-1，6键，利用这些酶水解，可以除去其他糖化酶对淀粉进攻的障碍，支链淀粉酶和真菌的联合水解作用，可以生产出发酵能力更强的葡萄糖浆，因为可发酵的麦芽三糖的产量增加了。支链淀粉酶如此命名是因为其对聚麦芽三糖具有很高的活性，聚麦芽三糖是一种由α-1，6键连接的麦芽三糖组成的多糖［9］。
1.3  根霉淀粉酶活力的测定
α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶活力的测定方法可根据国家部颁标准法进行。具体操作方法各种文献报道的比较多［13,14］。在实际应用中，各种淀粉酶的测定方法不尽相同。在过去100多年中，已有不少于200种淀粉酶的测定方法的报道［15］，根据其作用原理大致可分为3类：测定淀粉的消耗量，测定淀粉水解后的还原产物，色素测定法。
α-淀粉酶和糖化酶测定的方法报道比较多［16,17,18］。史永昶［19］等对常用的5种α-淀粉酶活力测定方法进行了介绍和比较，即Bernfeld法、临床检验法、部颁标准法、Fuwa改良法、Yoo改良法。笔者经实验发现Fuwa法和Yoo改良法比较适合测定细菌发酵液α-淀粉酶活力。部颁标准法中目视比色法误差太大。鱼红闪［20］等利用改进的碘兰色法测定α-淀粉酶活力，采用改进的DNS比色法测定糖化酶活力。
麦芽低聚糖酶活力的测定目前尚没有国家部颁标准方法，中外文资料也未见报道。刘建军［7］等参照部颁标准糖化酶的测定方法，制定了麦芽低聚糖酶活力测定方法。
2  不同的根霉糖化发酵糯米产物成分分析
根霉糖化发酵糯米的产物因根霉来源及其淀粉酶性质不同而不同。根霉降解糯米淀粉的产物富含糖类，包括糊精、葡萄糖、麦芽糖、低聚麦芽糖、异麦芽糖及其他还原糖类等。对这些成分的定性、定量分析可以采用高效液相色谱或者气相色谱或层析等方法。刘建军［7］等对其筛选到的一株根霉淀粉降解产物进行了如下方面的测定：DE值（％）、透光率（％）、色泽、酒精、流动性、葡萄糖（％）、麦芽糖（％）、麦芽三糖（％）、四糖一八糖（％）、其它（％）。并介绍了麦芽低聚糖纸层析的条件和高压液相色谱分析［23］。纸层析用于糖类的鉴定报道比较多［24］。还原糖的测定可采用碘量法［25］、菲林试剂法［26］等；总糖的测定可采用蒽酮法［27］。白冬梅［28］等提出了用高效液相色谱法同时测定米根霉乳酸发酵液中的有机酸和葡萄糖。活性低聚糖的测定及活性多糖的测定也有文献报道［7,29］。
3  前景展望
3.1  根霉淀粉酶全酶系及其降解产物的研究
最近对根霉单一酶研究报道较多，但整体地系统地研究其各种酶系的报道甚少，影响了根霉的扩大应用［30］。糯米甜酒富含有丰富的氨基酸、糖类、维生素等，对其生产工艺的报道比较多，而全面对其中的营养和风味成分如各种糖类的测定及香气成分的测定等的研究报道比较少。特别是对不同酒曲糖化发酵糯米的产物成分的分析与比较研究更少。研究根霉淀粉酶全酶系及其降解产物有利于根霉菌株的筛选和糖化发酵条件的控制，对开发保健甜酒具有重要的意义。
3.2  筛选根霉低聚糖酶产生菌
低聚糖（Oligosaccharide）的“低”意味着“寡少”，所以，别名为寡糖类或少糖类。通常，低聚糖是2～10个单糖以糖苷键结合物，11个单糖以上的结合物则称为大糖类，100～2000个单糖结合则称为多糖类。来源于淀粉原料的低聚糖以麦芽糖基（malto）词头，以糖为词尾构成，例如：麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖等［31］。常见的蔗糖、麦芽糖及乳糖等低聚糖都属于消化性低聚糖，在生物体内一般由消化酶分解为低分子的单糖而被吸收，作为能源使用。难消化性低聚糖不仅具有甜味料的作用，而且其生理功效与消化性低聚糖有着本质的区别，他们大多具有良好的溶解性、热稳定性和耐酸的性质，且保湿性良好，具有低热量和抗龋齿的特点，具有良好的整肠作用和提高机体免疫力的作用，按其开发产品结构的不同，有低聚果糖、低聚木糖、低聚麦芽糖、异麦芽低聚糖、聚半乳糖等［32］。我国只有异麦芽低聚糖产品和低聚果糖及大豆低聚糖的研究开发报道，其产品及产量很少。所以将来低聚糖在我国的开发前景会很好［33］。目前我国市场上的功能性低聚糖产品都是在成品中加入低聚糖，低聚糖的制作与原产品是独立的，筛选产低聚糖酶根霉直接用于甜酒制作具有广阔的前景。
3.3  根霉诱变育种
诱变育种是微生物筛选工作的一个重要的环节。微生物的诱变育种方法较多，物理方法有紫外线、γ-射线等，化学方法有LiCl、NTG等。袁静明［34］等从汾酒大曲中分离到一株根霉，经诱变处理后获得了具有高产葡萄糖淀粉酶的变异株。徐成勇［35］等通过比较试验，采用平板透明圈筛选法选得透明圈直径较大的根霉糖化酶产生菌株6株，并通过试饭糖化力实验对所筛选的菌株进行了比较。诱变育种还将是今后根霉筛选的重要方向。
3.4  混合菌种发酵生产甜酒
纯种根霉曲，由于使用了优良根霉，糖化力强，可以保证质量，但由于菌种太纯的缘故，风味单调，酒味尚感不足。如果把两种或两种以上根霉（即多菌种）混合制成曲种发酵，就可以互补，改善和提高产物的风味。柯文甫［36］等以地方小曲（自制药草曲）、纯种根霉Q303、生香ADY（安琪牌）、AADY（安琪牌）等混合搅拌均匀后，不改变工艺，比全小曲生产和全Q303根霉曲生产分别提高出酒率15％和10％以上，酒质含酯量分别提高60％和75％。混合制曲发酵或者单一菌种制曲混合发酵是甜酒生产中值得重视和研究的重要方面。◇

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