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李华丽1，何煜波2
（1湖南农业大学食品科技学院，长沙 410128；
2大连民族学院生物工程系，大连 116600）
摘 要：以pH值和感官评分为指标，就酸肉主发酵期盐浓度、葡萄糖浓度、接种量、发酵时间和发酵温度对酸肉发酵的影响进行了研究。通过设计正交试验表进行正交试验，确定了最佳发酵条件，即盐浓度0，葡萄糖浓度2％，接种量8％，发酵时间16h，发酵温度34℃。并对优化工艺条件酸肉发酵前后的主要理化特性进行比较，说明了发酵肉制品的优越性。
关键词：酸肉；米酒乳杆菌；主发酵期
发酵肉制品是以各类畜禽肉为原料，利用环境中的微生物或添加人工培养的发酵剂，经特定工艺发酵而制成的产品，如“金华火腿”、“宣威火腿”等。但其生产周期长，工业化生产规模受到限制，价格昂贵，不能满足日益增长的市场需求。少数民族地区特色性的发酵肉制品风味独特，营养丰富，产品保质期长，色鲜味美。侗族、苗族、傣族、毛南族等少数民族都喜爱吃的酸肉就是这样的典型产品。但缺少系统研究，生产仅停留在民间，没有实现商业化。酸肉可存放几年至数十年不坏，这可能是多重栅栏因子（Hurdle factor）的综合效能所致［1］。
但传统酸肉有很多不足的地方。食品安全得不到保障，因它是自然发酵，自然环境中难免有产毒微生物生长，这对食品安全来说是绝对不允许的；产品质量不稳定，民间生产的差异性和随机性很大，发酵条件难控制；高浓度的食盐对人体保健有害；生产周期长。这就要求我们对传统酸肉的生产工艺加以改进，以适应现代化工业规模生产的要求。
本试验在对传统产品研究的基础上（米酒乳杆菌约占乳酸菌数的37.6％），采用人工接种米酒乳杆菌恒温发酵，确定主发酵期最佳发酵条件，达到快速酸化的目的，为后期发酵创造良好环境。
1 试验材料
1.1 原料肉
市售新鲜猪肉（五花肉），切成3cm见方薄片。
1.2 菌种
米酒乳杆菌Lactobacillus sake（由湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供）。
1.3 培养基（MRS）
酵母膏0.5%，牛肉膏1％，蛋白胨1％，葡萄糖0.5％，乙酸钠 0.5％，柠檬酸二胺 0.2％，MgSO4?7H2O 0.02％，MnSO4?H2O 0.005％，K2HPO4 0.2％，吐温80 0.1％，pH 6.8。
1.4 主要仪器与设备
电子分析天平，精密pH计，高压灭菌锅，超净工作台，鼓风干燥箱，恒温箱，磁力加热搅拌器，半微量定氮仪，微量滴定管。
2 试验方法
2.1 菌种活化
将冷藏菌种用MRS培养基反复活化3次，在MRS加CaCO3，平板上涂布培养，选取溶钙圈大的菌落留做试验用。
2.2 接种液浓度计数
稀释平板计数法：接种液36℃培养24h，以10-8稀疏度于36℃培养，做3个平行样，记录菌落数。
2.3 酸肉的生产工艺
原料肉→切片→接种→发酵→入坛腌制→成品
↑ ↑
接种液制备 盐，米粉，茶叶等配料
2.4 测定项目及方法
2.4.1 pH值测定［5,6］ 称取10g样品研磨捣碎，于90ml蒸馏水浸提20min，过滤，取上清液用pH计测定。
2.4.2 总酸测定［7］ 准确称取10g样品研磨捣碎，于100ml容量瓶定容，浸提1h，过滤吸取20ml上清液于烧杯，加50ml蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.1N NaOH标液滴定至pH8.20，此时为总酸滴定终点，记下此时消耗碱液体积V1，同时做空白试验。用下式计算（以乳酸计）：
总酸（％） = (V1-V0)×0.096×0.09×100
m×(20/100)
2.4.3 氨基酸态氮（AN）测定［7］ 在上述总酸滴定终点基础上，加入10ml中性甲醛溶液混匀，开动搅拌器，继续滴定至pH9.20，记下碱液耗量V2，同时做空白试验。用下式计算（以氮计）：
AN（mg/l00g）= (V2-V0)×0.096×14 ×100
m×(20/100)
2.4.4 挥发性盐基氮（TVB―N）测定［7］ 用半微量定氮法，用下式计算：
TVB-N（mg/l00g）= (V1-V0)×0.009×14×100
m×(5/100)
2.5 最佳发酵条件的确定
根据单因素试验设计正交试验，确定最佳发酵条件，其因素与水平如表1：
2.6 感官评分
将前期发酵好的酸肉蒸熟，随意选取15～20人进行品尝（男女比例约为1：1），感官评分依据如表2，各项评分加和为综合感官评分。
2.8 酸肉发酵前后主要理化特性的比较
在优化工艺条件下将主发酵期完成后的酸肉与原料肉的pH值、总酸、AN和TVB-N进行比较。
3 结果与分析
3.1 接种液浓度计数结果
三个平行样的菌落数分别为82、88、96，平均菌落数为89，则接种液的浓度为为8.9×109cfu/ml.符合肉品发酵的最低浓度106cfu/g［8,9］。只有肉品发酵剂达到一定浓度，才能使发酵菌种在初始发酵时成为优势菌种，抑制杂菌的生长，保证发酵的顺利进行。
3.2 不同因素对发酵的影响
3.2.1 不同盐浓度下酸肉发酵后的pH值 盐浓度试验对酸肉主发酵期pH值的影响如图1：
由图1可看出，盐浓度对酸肉的pH值影响较大，随着盐浓度的上升，乳酸菌产酸能力下降，表明食盐对乳酸菌产酸有抑制作用。
3.2.2 不同葡萄糖浓度下酸肉发酵后的pH值 葡萄糖浓度试验对酸肉主发酵期pH值的影响如图2：
由图2可知，添加可发酵糖有利于乳酸菌产酸，酸肉pH值在0～1%浓度范围内变化较大，随着葡萄糖浓度上升，pH值下降速度加快，数值相差约一个pH单位。从曲线图上看，1%的葡萄糖浓度较为合适。
3.2.3 不同接种量下酸肉发酵后的pH值 接种量试验对酸肉主发酵期pH值的影响如图3：
由图3可知，随着接种量的增加，pH值下降速度加快。接种量大于6%时，pH值下降的加速度减小。不接种的样品部分腐败，说明乳酸发酵对产品保质有重要作用。
3.2.4 不同发酵时间下酸肉发酵后的pH值 发酵时间试验对酸肉主发酵期pH值的影响如图4：
由图4可知，随着发酵时间的延长，pH值逐渐降低，发酵18h时，pH值最低，随后产酸速度有下降趋势。
3.2.5 不同发酵温度下酸肉发酵后的pH值 发酵温度试验对酸肉主发酵期pH值的影响如图5：
由图5可知，36℃发酵pH值最低，随发酵温度降低或上升，酸肉产酸速度都下降。因为每一种乳酸菌都有一个最适宜生长的温度范围，当温度高于或低于此范围，其生长繁殖都会受到影响，且越远离此范围影响越大，从而影响产品的酸度［13］。本试验的菌种Ls的适宜生长温度范围为36～37℃，试验结果与此理论相符合。
3.3 正交试验结果
通过正交试验，试验结果及分析如表3。
由表3可知，无论是pH值还是感官评分，盐浓度对它们的影响最大。发酵因素对酸肉pH值的影响大小顺序为A>C>E>D>B。发酵因素对感官评分的影响大小顺序为A>E>C>B>D。对于产品的保质期来讲，pH值越低越好，其优水平为A1B3C4D3E2。感官评分为产品的酸度及后期加盐等辅料发酵提供参考，其优水平为A2B4C4D4E1。综合考虑发酵因素对两者影响的主次顺序和感官评分仅提供参考这个客观因素，酸肉主发酵期的最佳工艺条件为A1B4C4D3E1,即盐为0，葡萄糖2％，接种量8％，发酵时间16h，发酵温度34℃。
4 讨论及结论
（1）通过单因素试验，可以得出以下结论：
a.盐浓度对酸肉pH值有很大影响，盐浓度为0或1％时产酸速度达到理想水平。
b.葡萄糖浓度要适宜，浓度为1％时对产酸速度和生产成本较合适。
c.酸肉产酸速度随接种量的增加而加快。
d.在一定时间内，随着发酵时间的延长，pH值逐渐降低，发酵18h时pH值达最低值。
e.发酵温度越靠近菌种最适生长温度，其产酸速度越快。
（2）通过正交试验，确定酸肉最佳发酵条件为无盐，葡萄糖2％，接种量8％，发酵时间16h，发酵温度34℃。
正交试验的结论与单因素试验结论有所不同，这是正交试验中各因素互相影响的结果。
（3）通过酸肉发酵前后主要理化指标比较，证实发酵肉制品的优越性。
侗族、苗族传统发酵肉制品“酸肉”具有浓郁的民族特色，风味独特，营养丰富，正是这种巨大的市场开发潜力，有必要对其工艺条件进行改进，以适应现代化生产的要求。本研究采用先发酵后腌制的方法，不同于一般的先腌制后发酵或边腌制边发酵工艺。这样可以减少高盐和亚硝等腌制剂对发酵的阻碍，使发酵顺利进行，缩短发酵时间。◇
参考文献
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表3 正交试验结果
试验号 盐浓度A 糖浓度B 接种量C 发酵时间D 发酵温度E 试验结果
（％） （％） （％） （h） （℃） pH 感官评分
1 1（0） 1（0.5） 1（5） 1（12） 1（34） 4.85 60
2 1 2（1.0） 2（6） 2（14） 2（36） 4.45 65
3 1 3（1.5） 3（7） 3（16） 3（38） 4.18 60
4 1 4（2.0） 4（8） 4（18） 4（40） 4.41 65
5 2（1） 1 2 3 4 4.90 77
6 2 2 1 4 3 4.92 77
7 2 3 4 1 2 4.63 90
8 2 4 3 2 1 4.60 90
9 3（2） 1 3 4 2 4.74 86
10 3 2 4 3 1 4.57 92
11 3 3 1 2 4 5.25 65
12 3 4 2 1 3 4.86 80
13 4（3） 1 4 2 3 5.02 70
14 4 2 3 1 4 5.20 60
15 4 3 2 4 1 4.83 75
16 4 4 1 3 2 5.12 70
K1 17.87 19.51 20.14 19.54 19.85
K2 19.05 19.14 19.04 19.32 18.94
K3 19.42 18.89 18.72 18.72 18.98
K4 20.17 18.99 18.63 18.90 19.76
K1 4.47 4.88 5.04 4.89 4.96
K2 4.76 4.79 4.76 4.83 4.74
K3 4.89 4.72 4.68 4.68 4.75
K4 5.04 4.75 4.66 4.73 4.94
R 0.57 0.16 0.38 0.21 0.22
K1 250 303 272 290 317
K2 334 294 297 290 311
K3 323 290 296 299 287
K4 275 305 317 303 267
K1 62.5 75.8 68 72.5 79.3
K2 83.5 73.5 74.3 72.5 77.8
K3 80.8 72.5 74 74.8 71.8
K4 68.8 76.2 79.3 75.8 66.8
R 21 3.7 11.3 3.3 12.5
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