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赵玲艳，邓放明，杨细平，杨抚林
（湖南农业大学食品科技学院，长沙 410128）
摘 要：对从自然发酵辣椒中分离出的66株乳酸菌的抑菌特性进行了研究，结果发现66株乳酸菌中仅有28株对指示菌表现出抑菌活性，从这28株中选育出了三株具有广谱、高效抑菌作用乳酸菌，对这三株乳酸菌的抑菌成分进行了研究，最后发现起抑菌作用的物质是细菌素。
关键词：乳酸菌；抑菌特性；乳酸菌素；抑菌谱
细菌素（Bacteriocin）是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一种具有抑菌活性的代谢产物，通常是低分子量的多肽或者蛋白类物质［1-4］。很多研究表明：绝大多数乳酸菌在代谢过程中都会合成这种物质，通称为乳酸菌素（Lactobacillin）。不同的乳酸菌所产生的乳酸菌素是不同的，不同的乳酸菌素具有不同的抑菌谱和抑菌活性，有的乳酸菌素不具有抑菌活性。所以寻找广谱、高效抑菌性的乳酸菌素产生菌势在必行。Lact.1、Lact.2和Lact.3乳酸菌是从发酵辣椒中选育出的三株具有广谱、高效抑菌性的乳酸菌，本实验以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、产气杆菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、利斯特氏菌、植物乳杆菌为指示菌，研究了三株乳酸菌的代谢产物对指示菌的抑制作用。意在寻找纯天然的无毒或者低毒的食品防腐剂［5-6］。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种 从自然发酵辣椒中分离得到的66株乳酸菌（其中包括乳酸球菌和乳酸杆菌）。
1.1.2 标准菌株 选取不同类型的代表菌-革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，以测定所选育的乳酸菌种的抗菌特性，选育出具有广谱、高效抑菌活性的乳酸菌。没标来源的菌种都是湖南农业大学食品科技学院微生物实验室提供，菌种名称如下：大肠杆菌（Escherichia coli），变形杆菌（Proteus），沙门氏菌（Salmonella），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），产气杆菌（Clostridium perfringens），蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），利斯特氏菌（Listeria monocytogenes。内蒙古农业大学乳制品研究培训中心微生物研究室提供）。
1.1.3 培养基 MRS培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，大肠埃希氏菌培养基斜面，TSYE半固体培养基。
1.1.4 仪器与设备 pH计（HM-12P型），厌氧罐（BBL），分光光度计（V-2000型），光学显微镜（OLYMPUS BX50型），摄像系统（PM-20型），离心机（BECKMANGS 15R型），真空冷冻干燥机（LABCONCO牌LL-6SFPV型），浓缩干燥系统（EYELA型）等。
1.2 方法
1.2.1 产抑菌活性物质乳酸菌的筛选实验 （1）指示菌的培养及悬液的制备。（2）供试菌株一乳酸菌的的培养及代谢产物的收集。（3）Lact.1乳酸菌发酵浓缩液对杂菌抑制作用检测（牛津杯法和纸斤法）。
1.2.2 乳酸菌发酵产物提取以及抑菌成分的研究 经平板抑菌实验，筛选出三株具有广谱、高效抑菌作用的乳酸菌，命名为Lact.1、Lact.2、Lact.3。对Lact.1、Lact.2、Lact.3三株乳酸菌的代谢产物进行粗提，再分别对三株菌株代谢产物的抑菌成分进行研究。（1）硫酸铵的分级盐析。（2）硫酸铵盐析沉淀物的透析。（3）抑菌成分研究。
2 结果分析
2.1 广谱、高效抑菌活性的乳酸菌的选育的结果
通过平板抑菌实验，各供试菌对指示菌的抑制作用如表1所示。
通过平板抑菌实验，我们得到如下实验结果：其中编号分别为1、4、6、9、10、12、17、27、28、30、37、42、49、61的这14株供试乳酸菌对金黄色葡萄球菌有较明显的抑制作用。编号为15、18、36这三株供试乳酸菌对金黄色葡萄球菌、利斯特氏菌有非常明显的抑制作用，而对大肠杆菌、产气杆菌、蜡样芽孢杆菌也有一定的抑制作用。从实验结果可以看出：编号为 15、18、36的三株供试菌的抑菌范围最宽，抑菌效果最佳，最后筛选出15、18、36这三株供试乳酸菌为试验菌株，依次标为Lact.1、Lact.2和Lact.3。
2.2 Lact.1、Lact.2和Lact.3三株菌株的抑菌谱和起抑
菌作用的物质研究
为验证我们课题组选育得到的这三株优良菌株对杂菌特别是对腐败菌的抑制能力，我们做了抑菌试验。取MRS液体培养基，分别接种相关菌株，30℃静置培养16h，然后按上述方法得到各乳酸菌的发酵浓缩液，用碱中和至pH6.0以消除抑菌试验中有机酸的影响。以金黄色葡萄球菌、利斯特氏菌为指示菌，将指示菌活化，菌体细胞与融化至50℃的固体培养基混合后倒平板，用牛律杯法测定发酵液对指示菌的抑制作用。采用pH6.0的乳酸和以胰蛋白酶和过氧化氢酶处理过的发酵液作对照，结果如表2所示。
从上表可以看出：pH6.0的三株乳酸菌株的发酵浓缩液、用过氧化氢酶处理过的三株乳酸菌株的发酵浓缩液，对金黄色葡萄球菌、利斯特氏菌的抑制效果与不经过处理的原乳酸菌发酵浓缩液基本上是一样的，而 pH6.0的乳酸溶液对指示菌没有抑制作用，这说明抑菌作用并不是由于乳酸或者过氧化氢的作用而引起的。而三株乳酸菌株的发酵浓缩液用胰蛋白酶处理以后抑制作用消失，这表明起抑菌作用的因子可能是蛋白质性质的物质，因而可以初步断定发酵液的抑菌成分可能是乳酸菌分泌的细菌素。Lact.1所产细菌素的粗提液对金黄色葡萄球菌的抑直径达到35.6mm，对利斯特氏菌的抑直径达到32.8mm；Lact.2所产细菌素的粗提液对金黄色葡萄球菌的抑直径达到36.2mm，对利斯特氏菌的抑直径达到30.1mm；Lact.3所产细菌素的粗提液对金黄色葡萄球菌的抑直径达到28.6mm，对利斯特氏菌的抑直径达到30.8mm。而三株选育出来的乳酸菌之间的拮抗作用并不明显。
3 结论
本研究从自然发酵辣椒中分离出乳酸菌66株，对它们的抑菌作用作了研究，结果选育出三株具有广谱、高效抑菌作用的乳酸菌Lact.1、Lact.2和Lact.3。它们对金黄色葡萄球菌、利斯特氏菌有非常明显的抑制作用，对大肠杆菌、产气杆菌、蜡样芽孢杆菌也有一定的抑制作用。通过以金黄色葡萄球菌利斯特氏菌为指示菌，测定Lact.1、Lact.2和Lact.3三株乳酸菌代谢产物起抑菌作用的成分，最后可以得出三株乳酸菌代谢产物起抑菌作用的成分都是细菌素的结论。而细菌素本身可以被消化道中的酶降解，因而是一种潜在的安全无毒的食品防腐剂，而细菌素中的Nisin作为一种安全无毒的生物防腐剂，已经被美国、欧盟在内的50多个国家用于食品保鲜剂。这不仅为食品加工行业提供了一类广谱、高效、无毒（低毒）的纯天然的微生物防腐剂，而且证明从发酵辣椒中所选育的三株乳酸菌所产细菌素确实具有抑菌作用，从而为果蔬发酵提供了优良的菌株。◇
参考文献
［1］ M.E.Somders，T.R.Klaenhammer.2001.The Scientific Basis of Lactobacillus.acidophihs as Probiotic.J.Dairy Sci.84，319-331.
［2］ M.E.Sanders.1999.Probiotics.Food Techno1.53（1）： 67-77.
［3］ M.Van de Guchte，S.D.Ehrlich and E.Maguin.2001. Production of Growth-inhibitors by Lactobacillus delbrueckii.J.Appl.Microbiol.91，147-153.
［4］ T.I，Wirjantoro and M.J.Lewis.1996.Effect of Nisin and High temperature Pasterization on the Shelf-1ife of Whole Milk.J.Soc.Dairy.Techno1.49（4），99-102.
［5］ v.M.E.Marshall and A.Y.Tamime.Phyiology and biochemistry of Fermented Milks In Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk Blackie Academic Professional.1997.
［6］ T.I.Wirjantoro，M.J.Lewis，A.S.Grandison，G.C. Williams，and J.Delves-Broughton.2001.The Effect of Nisin on the Keeping Quality of Reduced Heat- treated Milks.J Food Prot，64， 213-219.
表1 产抑菌物质乳酸菌筛选结果
供试菌 指示菌 供试菌 指示菌
上清液 大 变 沙 金 产 蜡 利 上清液 大 变 沙 金 产 蜡 利
1 - - - ++ - - - 34 - - - - - - -
2 - - - - - - + 35 - - - - - - -
3 - - - + - - - 36 + - - ++ + + ++
4 - - - ++ - - - 37 - - - + - - -
5 - - - - - - + 38 - - - - - - -
6 - - - ++ - - - 39 - - - + - - -
7 - - - - - - - 40 - - - - - - -
8 - - - - - - - 41 - - - - - - -
9 - - - ++ - - - 42 - - - ++ - - -
10 - - - ++ - - - 43 - - - - - - -
11 - - - - - - - 44 - - - - - - -
12 - - - ++ - - - 45 - - - - - - -
13 - - - - - - - 46 - - - - - --
14 - - - - - - - 47 - - - - - - -
15 + - - ++ + + ++ 48 - - - - - - -
16 - - - - - - - 49 - - - ++ - - -
17 - - - ++ - - - 50 - - - - - - -
18 + - - ++ + + ++ 51 - - - - - - -
19 - - - - - - - 52 - - - - - - -
20 - - - - - - - 53 - - - - - - -
21 - - - - - - - 54 - - - + - - -
22 - - - - - - - 55 - - - - - - -
23 - - - - - - - 56 - - - - - - -
24 - - - - - - - 57 - - - - - - -
25 - - - - - - - 58 - - - - - - -
26 - - - - - - - 59 - - - + - - -
27 - - - ++ - - - 60 - - - - - - +
28 - - - ++ - - - 61 - - - ++ - - -
29 62 - - - - - - -
30 - - - ++ - - - 63 - - - - - - -
31 - - - - - - - 64 - - - - -
32 - - - - - - 65 - - - - - - -
33 - - - - - 66 - - - - - - -
注：大-大肠杆菌，变-变形杆菌，沙-沙门氏菌，金-金黄色葡萄球菌，产-产气杆菌，蜡-蜡样芽孢杆菌，利-利斯特氏菌
表2 Lact.1、Lact.2和Lact.3三株曲株的抑菌谱和起抑菌作用的物质研究（单位：mm）
指示菌
发酵处理液 Lact.1 Lact.2 Lact.3 李斯特氏菌 葡萄球菌
Lact.1发酵浓缩液 - - - 32.8 35.6
Lact.1发酵浓缩液（pH6.0） - - - 32.8 35.6
Lact.1发酵浓缩液（胰酶处理） - - - - -
Lact.1发酵浓缩液（过氧化氢酶） - - - 32.8 35.6
Lact.2发酵浓缩液 - - - 30.1 36.2
Lact.2发酵浓缩液（pH6.0） - - - 30.1 36.2
Lact.2发酵浓缩液（胰酶处理） - - - - -
Lact.2发酵浓缩液（过氧化氢酶） - - - 30.1 36.2
Lact.3发酵浓缩液 - - - 30.8 28.6
Lact.3发酵浓缩液（pH6.0） - - - 30.8 20.6
Lact.3发酵浓缩液（胰酶处理） - - - - -
Lact.3发酵浓缩液（过氧化氢酶） - - - 30.8 28.6
PH6.0乳酸 - - - - -
注“-”表示没有抑菌作用或者作用不明显，各数字表示供试菌对指示菌抑菌直径的大小。
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