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杜 林1，李亚娜2
（1仲恺农业技术学院食品科学系，广州 510225；2中山大学化学与化学工程学院，广州 510275）
摘 要：对生物活性肽的研究进展进行了综述，重点阐述了生物活性肽的分类和合成方法，并对发展前景进行了展望。
关键词：生物活性肽；合成；脱苦
生物活性肽是指具有生物活性的多肽，这些多肽小到只有2个氨基酸的双肽，也可以大到复杂的长链或环状多肽，而且常经过糖苷化、磷酸化或酰化衍生，在细胞生理及代谢功能的调节上具有重要的作用。特别是短肽的发现已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂的开发热点。
以数个氨基酸结合生成的低肽比氨基酸有更好的消化吸收性能，且营养和生理效果更为优越。不仅如此，其中许多肽还具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能。这些生物活性肽都以非活性状态存在于蛋白质的长链之中，当用适当的蛋白酶水解时，它们的活性就被释放出来［1］。
1 生物活性肽的分类
按照功能的不同，可分为以下几类［2］。
1.1 生理活性肽（Physiogically Active Peptides）
1.1.1 抗菌肽和抗病毒多肽 包括由细菌与真菌而来的环肽、糖肽、脂肽等；另外,Yingzhang［3］从蚕豆（Vicia faba）这种豆类植物中也获得了植物抗菌肽，命名为Fabatine,但它只对革兰氏阳性和阴性细菌有效，而对酵母无效；Holz［4］研究了真核和原核生物中核糖体合成的抗菌肽，如：杆菌素、昆虫防御素、attacin和脊椎动物中的抗菌肽。
目前有天然抗菌肽在医药上的应用，运用到食品工业上有部分取代化学防腐剂的趋势，如Nisin的使用。
1.1.2 神经活性肽 主要存在于牛乳、鲔鱼、大豆及其它豆类等许多食品蛋白质的水解物中，如酪激肽、乳啡肽、α-内啡肽（α-endorphin）、亮氨酰-脑啡肽（Leu-enkephalin）、甲硫氨酰-脑啡肽（Met-enkephalin）。它们能调节神经的信息传递，现已成为食品药理学的焦点之一。
1.1.3 酶调节及抑制肽 这类多肽参与了许多生化代谢的途径，其中可以抑制血管收缩素转换酶（ACE）活性的多肽已经被用作抗高血压的药剂［5］，其蛋白质序列C端多半为脯氨酸，且可以在牛乳酪蛋白、鱼肌肉、玉米蛋白质等水解物及许多发酵食品中发现。
1.1.4 激素及激素调节肽 包括垂体后叶催产素（Dxy-tocin）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、垂体后叶加血压激素（Vasopresssin）、生长激素抑制素（Somatostatin）等，它们具有促进平滑肌收缩、促进类固醇合成以及促进血管收缩的功能。
1.1.5 免疫活性肽 人体内的中间白色胞素（interl-eukin）与干扰素（interferon）是一些可以活化与调节免疫反应的多肽，而食品成分中的一些多肽片段也被发现具有免疫活性，如来自γ-麦醇蛋白中的N端八肽。除此之外，还包括来自一些病原微生物的免疫诱导表面肽、糖肽，以及一些非食物和食物来源的变异原等。
1.2 其它生物活性肽
科学工作者已从植物和动物蛋白质中分离出了多种毒素，如：蓖麻蛋白（ricin）、刀豆球蛋白（concavalins）、红豆碱（abrin）和蜂毒（mellitin）等；具有抑制酶（尤其是胃蛋白酶）活性的多肽在豆类植物中被发现，这类酶抑制肽会降低蛋白质的生物利用率，但有趣的是，它们在体内却有抑制癌变的潜力；其它食物来源肽，如磷蛋白肽可与二价或三价微量元素（钙、镁和铁）螯合而加快矿物质在体内的运输；一些食物来源肽还具有微妙的生理作用，如来自奶酪乳清中的“唾液酪蛋白巨肽”对食欲有控制作用。
长期以来，对多肽的研究集中在内源生物活性肽的医学作用上，而它们在食品质构中的作用则是最近的研究热点。已经认识到多肽对食品感官风味存在一定的影响，在有些食品中（尤其是奶酪），它的苦味、甜味、酸味以及肉汤味和杏仁味的产生都认为与乳蛋白水解产生的某些肽类有关。有的研究还发现，多肽对提高冻藏肉的风味也有贡献，在最近几年内，已有大量食品来源的多肽被分离和鉴定，其开发重点是食品甜味剂、抗氧化剂、风味剂和营养强化剂。
1.2.1 感官肽（sensory peptides） 阿斯巴甜二肽和天门冬酰丙氨酸酯是甜度较高，且不产能的甜味剂。迄今为止，阿斯巴甜被75个国家核准使用在数百种的食品和保健产品中，其商业化的成功，促使了更多甜味剂的研究。现已发现了甜味剂的几种新型结构，如含赖氨酸的转化阿斯巴甜二肽、氨基丙二酸二肽，它们可作为阿斯巴甜的替代物，而且在食品加工中不象阿斯巴甜那样呈现酯的性质，所以更为稳定。
天然多肽甜味剂的来源主要是一些植物蛋白，如：莫那灵（monellin）、沙马汀（thaumatin）、仙茅甜蛋白（curculin）、马槟榔甜蛋白（mabinlin）等，它们已进入到产品利用上的评估阶段，可以用作精选食品的甜味剂。而且curculin和另外一种水果双肽miraculin，还能掩蔽酸味，使之转化为甜味。
虽然大多数情况下要避免食品产生苦味，但在许多食品中，如：啤酒、咖啡、水果汁和奶酪，苦味却是其中一个重要的感官成分。已从发酵食品中，如奶酪、可可、沙淇酒和蛋白质水解物中分离出了苦味肽，并对其进行了初步的构象―呈味关系研究，结果发现苦味主要由分子中的疏水性氨基酸和碱性氨基酸造成的［6］。现在已提出多种模型解释多肽苦味与特殊氨基酸的存在、它们在多肽中的相对位置以及多肽的整体构造之间的关系。
酸味肽对酸味和Umami风味的形成是必需的,Umami风味与谷氨酸单钠（MSG）风味相似，是由含有谷氨酸和天门冬氨酸二肽和三肽的钠盐所致（若是游离氨基酸形式则不呈酸味，若含有γ-谷氨酸的多肽则有涩味）。Umami风味是许多食品风味的基本成分，研究发现，具有Umami风味的多肽顺序为Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Se-Leu-Ala，这种八肽最早是从木瓜蛋白酶处理后的牛肉中分离得到，被称为“美味肽”，是构成牛肉汤风味的主体［7］。美味肽的风味是由其结构中的3部分共同作用的结果：N-端碱性二肽Lyn-Gly，中间酸性三肽Asp-Glu-Glu和C-端三肽Ser-Leu-Ala。若将上述3种成分混合，或用orn-γ－Ala（咸味肽）代替其中的碱性三肽组分，或则Glu-Glu代替其中的酸性三肽组分，也能产生类似“美味肽”的风味和阈值。
某些碱性二肽具有很浓的咸味，协同构成了Umami风味，但其味感与氨基酸的离子化程度和反离子的存在有很大关系。Umami风味和咸味肽的协同运用主要是作为糖尿病人和高血压患者以及保健食品中的“无钠”调味料。
多肽在食品风味里发挥的作用并不仅局限于它们对基本味的贡献，象Glu-Leu、Pro-Glu或Val-Ghu等二肽是通过它们的缓冲作用而增强食品风味的；而谷氨酸寡聚肽则是以苦味掩蔽剂的形式添加到蔬菜汁或果汁中；γ－谷胺酰多肽是葱类的风味前体；在面包、可可和花生发酵时释放出的短肽，它们能在焙烤时形成多种杂环芳香族的化合物，这是通过多肽与糖的美拉德反应及其降解而形成的［8］。相对而言，对氨基酸在热降解时产生风味物已做了深入的研究，而对多肽在这些反应中的作用却研究得较少。
1.2.2 抗氧化肽 某些多肽及蛋白质水解物可以降低油脂食品的自动氧化速率与过氧化物的含量，其原理不外乎捕捉金属离子或者是促进过氧化物的降解。美拉德反应产物--类黑精能与重金属离子螯合（尤其是铁）而形成无氧化力的复合物，从而降低氧化速率。大部分抗氧化肽的片段中含有组氨酸［9］。
肌肽（camosine，β-Ala-His）是存在于动物肌肉中的一种天然二肽，能抑制体外由铁、血红素、脂氧化酶和单线态氧催化的脂氧化，也能抑制蒸煮肉在冷藏时的氧化酸败，因而在肉制品工艺中具有极好的应用前景，可作为天然抗氧化剂使用。抗氧化活性肽如肌肽、谷胱甘肽、大豆蛋白酶解物等作为天然抗氧化物具有低毒、高效等特点，具有应用的优势［10］。
含有寡肽的各类天然食品都能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性，如土豆和蘑菇中含有低分子二肽（约1000Da）能抑制苹果干和葡萄汁中的PPO。除此之外，这些肽可能还直接与PPO的催化产物醌作用而阻止了黑色多聚氧化产物的形成，从而降低了酶促反应的速度。
1.2.3 表面活性肽 酶水解蛋白质时常常会破坏蛋白质的功能性质。但在某些情况下，酶水解却能提高蛋白质的功能性质，这一方面是由于产生了具有较低结构级数（二级）的多肽，另一方面是由于提高了蛋白质在等电点附近的溶解度。我们经常从酪蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白和面筋蛋白水解物中获得多肽，如一些酪蛋白多肽段：α－S1-CN（1-23）、β-CN（193-209）和β-CN（1-25）等，它们在食品中就具有很好的稳定性和乳化能力，从而改善了酪蛋白的功能性质。此外，对蛋白质进行适度水解，还可以提高其起泡性。在啤酒泡沫的成分中，含高分子多肽、糖肽和类黑精，这些表面活性剂对泡沫的形成和稳定起着关键的作用。
1.2.4 营养肽 在营养不良或消化吸收有问题的病人的配方食品上，多肽或蛋白质水解物已经逐渐取代氨基酸作为氮源的应用。人们已经证明二肽与三肽被人体吸收的效率较氨基酸高［7］。将γ－Glu-Lyn强化在小麦面筋中制造面包是非常好的Lyn来源，常在苯丙酮酸尿病患者膳食中添加由游离苯丙氨酸构成的多肽。而且由于多肽的低抗原性使其对牛乳蛋白过敏儿童的低过敏婴儿配方食品中得以广泛的应用。
从人乳和牛乳蛋白中分离获得的营养活性肽是关注的焦点，一些来自酪蛋白和β－casomorphin的磷酸肽已经作为膳食强化剂和药物在使用。它们具有广泛的生理活性，如：免疫调节、预防高血压、抗凝血和调节矿物质的吸收等，因此奶制品或乳制品既是营养品，又是生理活性物质。虽然对牛乳肽在体外的作用有大量的研究，而对其在体内的重要作用至今尚不清楚。
以上讨论了多肽在食品和医药工业中的应用，但是大规模合成或从天然资源中分离活性肽实际上非常困难，且费用昂贵，这是限制多肽产品面市的主要原因。因此，许多学者努力寻求其它途径来大规模生产多肽。
2 多肽生产
2.1 概述
生物技术的发展，为人们从食品蛋白质中生产特殊的活性肽提供了条件。人们获得活性肽的来源有：①存在于生物体中的各类天然活性肽（激素类、酶抑制剂等）；②消化过程中产生或体外水解蛋白质产生；③通过化学方法（液相或固定相）、酶法、重组DNA技术合成。
在过去10年，对多肽合成已进行了一些基础研究（主要是一些高价值药物肽）。如生物活性肽类似物、蛋白酶和激酶底物以及病毒表面蛋白序列（产生位点专一抗体）的合成。具体选用哪一种应根据所需肽的链长和质量而定。目前酶法合成只局限于短肽的合成，而重组DNA技术则能合成大分子肽（含高达几百个氨基酸残基的巨肽），固相合成法则是用来合成中等链长多肽的主要方法。
2.2 化学合成法
实验室水平下常用化学合成法，按其合成介质可分为“液相合成”和“固相合成”。固相合成法在20世纪60年代才出现，与传统的液相合成法并驾齐驱，其优越性在于固相载体有利于合成中不断增长的肽链固定、环化、去保护和纯化，且易实现自动化。然而，由于设备和试剂的昂贵严重限制了固定相合成法在规模化生产上应用。目前主要在合成含有10～100个残基的多肽或为筛选而快速建立多肽库时应用。虽然液相合成法是合成小分子肽的浓缩多肽片段的有效方法，但化学合成法本身具有下述缺点：①消旋化和副反应；②需要对肽侧链中的基因进行保护，尤其是固相合成时；③需过量的链接试剂和酰基载体；④链接试剂的毒性残留影响制品和环境。
2.3 重组DNA法
重组DNA法没有上述缺点，但需要一个长期的研究与开发阶段。若一旦建立起了一个重组DNA体系，就可以利用廉价的原料经发酵大量生产活性肽，如果有望成功，将会有广阔前景。然而迄今即使用此法来制备小分子肽也没有取得成功。
2.4 酶法
采用酶法生产是当前研究的热点，因其安全性极高、价廉、易于推广而引起人们的极大兴趣。
大多数活性肽的生产流程为：原料蛋白→预处理→酶解→分离→精制→成品。
酶的选择是生产活性肽的关键。目前商业用酶主要是微生物酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶及复合酶）、植物蛋白酶及少量的动物蛋白酶，当前的研究者常常要从大量的酶中进行筛选，虽能根据原料蛋白的组成和酶的专一性作为参考，但仍存在较大的盲目性。因此，研究者可根据活性肽的结构特点，通过酶工程来生产特定的酶类［11］。由于单凭一种酶有时很难达到预期效果，可用复合酶系［12］。尽管人们在生产中已采用了复合酶系，但由于酶反应体系是一个复杂的体系，共同作用机理仍有待于进一步的探讨［13］。
另外，也有研究者直接利用微生物在原料中发酵，如Leblanc等用瑞士乳杆菌发酵牛奶得到抗大肠杆菌O157：H7感染的多肽［14］。利用基因工程对生产生物活性肽的酶进行改造，从而获得新特性的活性肽，也会是一个重要的发展方向［15］。
2.5 酶法生产存在的问题和解决方法
2.5.1 存在问题
虽然采用酶法成功合成了许多复杂的多肽序列，如阿斯巴甜。但酶在水相中存在的问题越来越明显，最主要的是副反应多，特别是对肽键的水解，导致在合成大分子寡肽时会产生大量副产物；另外一个问题就是许多氨基酸衍生物在水中的稳定性很差。虽然“非水相酶学”获得了长足的发展，但现仍局限在模型二、三肽的合成。
此外，在蛋白质酶水解时会形成苦味肽，这严重限制了蛋白质水解物的利用。水解物的苦味是由含一个疏水区和一个亲水区，二者相距3A的肽产生，其中氨基与亲核接受器的相互作用和疏水相互作用而引起苦味。苦味是蛋白质酶解的必然结果，其强弱程度是决定水解物在食品中应用的关键因素。因此许多脱苦方法应运而生，包括选择性分离、掩蔽、酶处理/多肽外切酶的应用。
2.5.2 解决办法
（1）选择性分离 最早用活性炭对酪蛋白水解物进行选择性分离来脱苦。其机理是，活性炭作为疏水吸附剂与疏水性苦味肽及氨基酸结合。其它疏水吸附剂还有琼脂疏水色谱、双氧树脂纤维素、酚醛树脂和免疫专一吸附剂等。另外，用水合乙醇能有效地去除苦味肽，此法可用于工业化生产中。
但是通过吸附的方式除掉苦味肽时，会引起蛋白质和氨基酸的损失，降低营养价值。
（2）掩蔽 有许多物质能够掩蔽水解的苦味，如五聚磷酸盐、胶原蛋白、甘氨酸环状糊精等。将苦味肽和蛋白质混合，能有效降低苦味，这是因为蛋白质和氨基酸及多肽之间有亲合力。众所周知，苦味与酸味混合可减轻苦味，因而，也可用谷氨酸或天门冬氨酸掩蔽苦味但产品有点酸涩。若添加过量的牛磺酸后，产品可不带酸味。
（3）酶处理/多肽外切酶的应用 类蛋白反应（Plastein Reaction）是一种有效脱苦方法，将部分水解的蛋白物与特定的蛋白酶保温后能形成“类蛋白”，这是一类类似蛋白质的高分子物质，与原蛋白质的性质不同，且不再有原来的特殊风味。
3 研究开发生物活性肽的前景
源于蛋白质的活性肽是一种多功能因子，其组成氨基酸并不一定是必需氨基酸，这就为人类更为充分利用那些原本认为生物价不高的蛋白质资源，从而生产出更能满足人类保健需要的基料提供了新的机遇。
我国有大量丰富蛋白质资源，由于原料利用率不高，农副产品加工中产生的大量下脚料和工业废物中含有大量的蛋白质。若采用生物技术进行蛋白质的深加工，会有广阔的社会效益和经济效益。◇
参考文献
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