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吴爱芳，曾 丹，申贵隽
（大连大学环境与化学工程学院，大连 116622）
摘 要：采用国家标准方法（GB5009，32-85）“盐酸萘乙二胺法测定肉制品中亚硝酸盐含量”，利用亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮化反应的化合物与盐酸萘乙二胺偶合成红紫色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐的含量成正比的原理，建立制备快速测定亚硝酸盐的新方法―试纸法。试纸法作为一种快速的现场检测方法，其特点是操作简单、携带方便、价格便宜、检测快捷，并具有一定的选择性、准确性和灵敏度。对指导生产及市场流通质量控制，保障食品安全具有一定的实际意义。
关键词：亚硝酸盐；试纸法；肉类熟食制品；快速检测
亚硝酸盐是作为发色剂使用于腌制香肠、腊肉和火腿等肉制品中，因其可缓慢的分解释放出氧化氮 （NO），使肉中的肌红蛋白亚硝基化形成稳定的亚硝基肌红蛋白色素，从而保持肉制品中的固有色泽；另一方面，亚硝酸盐还具有防腐作用，能够抑制肉毒梭状芽孢杆菌，防止肉类制品的腐败变质。但是，亚硝酸盐不仅本身具有毒性，往往因使用过量或使用方法不当而导致食物中毒发生。因为进入体内的亚硝酸盐常常与蛋白分解生成的胺类结合成强致癌物亚硝胺。
若熟肉制品中亚硝酸盐残留量过高，必然导致这种潜在危险的增大。硝酸盐及亚硝酸盐被用于肉类食品中，硝酸盐本身具有一定杀菌作用，大部分的应用可能会转化少量的亚硝酸盐。本文重点介绍肉类熟食制品中亚硝酸盐快速检测。
1 亚硝酸盐在肉制品中的呈色作用
肌肉（瘦肉）所以呈现不同的红色，是由于所含的色素蛋白质的变化引起的。肌肉中色素蛋白质主要是肌红蛋白和少量的血红蛋白，肌红蛋白是血红素和珠蛋白构成的一种复合蛋白质，血红蛋白也同样是珠蛋白和血红素所构成的复合体。血红素中含有铁元素，当铁是二价时称血色原，呈紫红色；而当血红素中的铁由二价氧化成三价时，称为高铁血色质，呈褐色。肌红蛋白分子构成中的铁具有结合水的能力，当其以水分子的状态结合时，被氧置换形成氧合肌红蛋白。氧合肌红蛋白呈红色。
未经腌制的肉加热时，肌红蛋白中的珠蛋白部分发生变性，结果失去了防止血红素氧化作用，因此，血色素很快被氧化成高铁血色质呈灰褐色。氧合肌红蛋白中的氧分子可以被一氧化氮等置换，生成一氧化氮肌红蛋白（MbNO），难于解离，并具有鲜艳明亮的红色。当加热的时候，尽管珠蛋白部分发生变性，但由于一氧化氮与血红素难解离，生成变性珠蛋白一氧化氮血色质，此时一氧化氮-血色原仍保持鲜艳的红色，腌制后的肉类热加工时，颜色也不发生变化。
一氧化氮-肌红蛋白是构成腌肉颜色的主要成分，一氧化氮基是由硝酸盐或亚硝酸盐，在腌制过程中经过复杂的变化而形成的。
2 硝酸盐、亚硝酸盐的测定方法
2.1 光度法
2.1.1 分光光度法 分光光度法目前广泛采用的是盐酸素二胺分光光度法和酚二磺酸分光光度法。这2种方法均为水质分析方法标准，最低检出浓度亚硝酸盐为0.003mg/L（试份体积为50ml），硝酸盐最低检出浓度为0.02mg/L（试份体积50ml），水样中某些共存离子对测定产生干扰，需作适当前处理以消除对测定的影响。此外，所用试剂如盐酸萘乙二胺等有毒性，且操作较繁琐。近年来，许多分析工作者致力于高灵敏度亚硝酸盐和硝酸盐的分析方法研究。
2.1.2 紫外分光光度法 紫外分光光度法测定硝酸盐和亚硝酸盐，人们关注的研究课题之一是探索不经任何分离而同时测定NO3-和NO2-。该法具有较好的准确度和精密度，操作简便，计算准确，速度快，是一种很有应用前景的方法。
2.1.3 荧光光度法 荧光光度法灵敏度高，近年来对荧光光度法测定NO2-和NO3-的研究增多。
2.2 催化动力学法
高甲友等研究了亚硝酸根对溴酸钾氧化罗丹明B的催化效应，提出了一个新的测定痕量的NO2催化荧光和催化光度法。郑肇生等利用高灵敏的动力学法与高灵敏的荧光检测相结合，报道了溴酸钾氧化荧光素动力学荧光法测定痕量NO2-，可直接测定水样中亚硝酸根，回收率为96％～106％。
催化光度法测定亚硝酸根，已报道了以溴酸钾作氧化剂，对氮蒽染料、偶氮染料、三苯甲烷染料和蒽醌染料做指示物质，其中郑肇生等提出的溴酸钾氧化蒽醌染料一茜素绿催化光度法测定水中亚硝酸盐，是目前动力学法测定亚硝酸最灵敏反应之一。杨书润等基于在稀硫酸介质中 NO2-对溴酸钾氧化键的催化效应，采用流动注射停流技术，建立了NO2-的快速分析方法，用该法测定自来水、雨水、湖水和生活污水中NO2-加标回收率为94％～100％，操作简便、快速。
门瑞芝等研究了甲基橙动力学法测定水、食品和蔬菜中NO3和NO2，在紫外光照射下甲基橙褪色程度与NO3和NO2含量成正比，该法首先测定二者的总量，然后在氨基磺酸存在下测定NO3-的量，再差减求得NO2-的量。
2.3 极谱法
极谱法测定NO2-用于水样和蔬菜中NO2-的测定，选择性好，灵敏度高。
2.4 色谱法
2.4.1 离子色谱法 用该法测定蔬菜中NO2-和NO3-，添加不同浓度标准液的回收率在85％～110％之间。
2.4.2 反相离子色谱法 辛梅华等报道了反相离子对色谱法一电化学检测测定NO2-等离子的方法。以峰高一外标法定量，样品中高倍量常见离子不干扰NO2-的测定，用该法测定地面水和废水中NO2-，加标回收率为92.0％～94.5％，NO2-检出限为0.55ng/ml，线性范围0～3.0μg/ml，相对标准偏差为1.5％，方法快速、灵敏、选择性高。
2.5 表面活性剂法
2.6 传感器法
2.7 发光分析法
2.8 试纸法
在试纸上进行反应，就是把化学反应从试管里移到滤纸上进行，按反应本质说，都是利用迅速产生明显颜色的化学反应定性或定量检测待测物质。试纸的制作方法比较简单，一般是将试剂配成溶液，浸渍到纸基上，以适当的方法干燥。也有将试剂（要求有一定的稳定性，多为染料）分散和纸浆一道制成试纸。
目前制作试纸普遍采用的干燥方法有自然晾干、冷风吹干、烘干以及真空干燥等。测定时试纸与被测物接触的方式主要有：自然扩散、抽气通过（需有抽吸装置）、被测样品滴在纸片上或将纸片插入溶液中。被测物与试纸接触后，在试纸上发生化学反应，试纸的颜色发生变化。根据检测样品的不同，用试纸法测定样品的全部时间有的只需几秒，最长一般也只需几十分钟。试纸法测定样品，主要是通过与标准比色卡比较，进行目视定性或半定量分析。
试纸法具有以下优点：（1）检测速度快，且具有一定的灵敏度和专性；（2）结构简单，携带方便，非常适合现场快速检测：（3）操作简单，使用者不需专门培训就能掌握；（4）价格便宜，不需检修维护，一次性使用。同时试纸法在某些方面还存在一定的不足：由于试纸上能够固定的试剂量有限，有些试纸的灵敏度还达不到检测要求，检出限有待于进一步提高。另外很多现有比较成熟的测定方法不适用于试纸法，国内开发和生产的试纸种类有限，现有试纸还远远不能满足现场检测的需要。
亚硝酸盐的测定方法虽然较多，灵敏准确，但大都操作烦琐，时间较长，需要昂贵的仪器设备，不适用于快速测定，不利于推广和应用。而试纸法比其他方法具有更多的敏感性。为此试纸法作为一种简捷地测定亚硝酸盐的快速分析方法具有重要意义。
试纸法的标准方法是GB5009，32-85的盐酸萘乙二胺法：在酸性条件下，猪肉熟制品中的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸酰胺重氮化后，再与盐酸萘乙二胺发生偶合反应生成紫红色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐的含量成正比。
3 问题与讨论
3.1 试纸显色反应的酸度条件
亚硝酸盐与对氨基苯磺酸的重氮化反应，需要强酸条件生成的重氮化合物较稳定，但不利于重氮化合物与萘乙二胺的偶合反应；偶合反应需要中性或弱酸性条件。在重氮偶合反应所需的弱酸性条件下，重氮化反应仍能进行，生成的重氮化合物不稳定，利用偶合反应的进行。
3.2 试纸纸张的选择
（1）普通纸张：采用普通纸张，由于吸附能力较弱，纸质差，容易破碎，烘干后药品残留量低，使用后，其显色能力不明显，所以不予采用。（2）滤纸：可供选择的有普通滤纸、定量分析用滤纸，后者效果较前者好，所以采用定量分析用滤纸。
3.3 缓渗层滤纸的研究
采用硅胶溶液浸泡使滤纸具有缓渗作用，可防止样液因渗透速度太快所引起的样液在发色层分布不匀情况的发生，避免色斑颜色不匀。
3.4 试剂配制（2种发色剂浓度）
参照标准方法配制试剂浓度而制成的试纸条，反应时间较长，偶合生成的红紫色受氧化条件影响易褪色。基于实验过程中出现的具体问题，我们改变试剂浓度来提高测量进度和灵敏度，在对氨基苯磺酸（A）和盐酸萘乙二胺（B）浓度比不变的情况下，扩大配制试剂的浓度，从而缩短测量时间，提高了灵敏度。
3.5 试纸法展望
作为一种快速的现场检测方法，试纸法在食品、水质、医疗卫生等各个领域都具有十分广泛的应用。各种新型显色剂和高灵敏度的显色体系不断涌现，为建立高灵敏度的试纸检测方法提供了更大的发展空间。有机试剂的引入、多元络合物的出现以及表面活性剂的应用，极大地促进了光度分析的发展。通过向某些难溶反应体系中加入表面活性剂，不仅可以提高试剂的溶解度，而且可以大大改善反应的稳定性，提高检测方法的灵敏度。随着适用于试纸法检测的微型仪器的出现，由传统的定性半定量检测逐渐转化为精确的定量分析，为试纸法提供了更广阔的发展前景。开发某些检测项目的特效试剂，研制更多性能优良的试纸，从而提高试纸检测方法的灵密度，扩大检测范围，具有非常重要的意义。◇
参考文献
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